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		微生物接種、培養(yǎng)、分離工具、常規(guī)鑒定技術(shù)匯總

　　接種

　　將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過(guò)程叫做接種。

　　接種和分離工具

　　1.接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀

　　常用的接種方法有以下幾種：

　　1、劃線(xiàn)接種

　　這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來(lái)回直線(xiàn)形的移動(dòng)，就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線(xiàn)中就常用此法。

　　２、三點(diǎn)接種

　　在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來(lái)觀(guān)察、研究它們的形態(tài)。除三點(diǎn)外，也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的。

　　３、穿刺接種

　　在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí)，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線(xiàn)穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng)，則在穿刺線(xiàn)周?chē)軌蛏L(zhǎng)。

　?。础不旖臃N

　　該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45°c左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落。

　?。?、涂布接種

　　與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來(lái)回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物的菌落。

　?。?、液體接種

　　從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱(chēng)為液體接種。

　?。贰⒆⑸浣臃N

　　該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動(dòng)物中，常見(jiàn)的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來(lái)預(yù)防某些疾病。

　　８、活體接種

　　活體接種是專(zhuān)門(mén)用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長(zhǎng)繁殖。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物；也可以是某個(gè)離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。

　　注：有所接種必須無(wú)菌操作

　　培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無(wú)菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操作。

　　(1)接種滅菌 (2)開(kāi)啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞。

　　分離純化

　　含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱(chēng)為混和培養(yǎng)物（mixed culture）。如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱(chēng)為純培養(yǎng)（pureculture）。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過(guò)程稱(chēng)為分離純化，方法有許多種。

　　１、傾注平板法

　　首先把微生物懸液通過(guò)一系列稀釋?zhuān)∫欢康南♂屢号c熔化好的保持在40-50°左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。

　?。?、涂布平板法

　　首先把微生物懸液通過(guò)適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)∫欢康南♂屢悍旁跓o(wú)菌的已經(jīng)凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無(wú)菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落。

　　３、平板劃線(xiàn)法

　　最簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線(xiàn)法。用無(wú)菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線(xiàn)。劃線(xiàn)的方法很多，常見(jiàn)的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線(xiàn)方法有斜線(xiàn)法、曲線(xiàn)法、方格法、放射法、四格法等。當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋?zhuān)詈笤谒鶆澋木€(xiàn)上分散著單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成一個(gè)菌落。

　?。础⒏患囵B(yǎng)法

　　富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡(jiǎn)單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng)，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，在生長(zhǎng)能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他微生物。如果要分離一些專(zhuān)性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長(zhǎng)。通過(guò)多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。

　　５、厭氧法

　　在實(shí)驗(yàn)室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無(wú)菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用n2或co2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時(shí)為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。

　　6、單細(xì)胞（或單孢子）分離法

　　是采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。較大的微生物，可采用毛細(xì)管提取單個(gè)個(gè)體。個(gè)體相對(duì)較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。單細(xì)胞分離法對(duì)操作技術(shù)有比較高的要求。

　　培養(yǎng)

　　1、根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類(lèi)。

　　好氧培養(yǎng)：也稱(chēng)“好氣培養(yǎng)”。就是說(shuō)這種微生物在培養(yǎng)時(shí)，需要有氧氣加入，否則就不能生長(zhǎng)良好。在實(shí)驗(yàn)室中，斜面培養(yǎng)是通過(guò)棉花塞從外界獲得無(wú)菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過(guò)搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。

　　厭氧培養(yǎng)：也稱(chēng)“厭氣培養(yǎng)”。這類(lèi)微生物在培養(yǎng)時(shí)，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過(guò)程中，最重要的一點(diǎn)就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。

　　２、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類(lèi)。

　　固質(zhì)培養(yǎng)：是將菌種接至疏松而富有營(yíng)養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中，在合適的條件下進(jìn)行微生物培養(yǎng)的方法。

　　液體培養(yǎng)：在實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)液體培養(yǎng)可以使微生物迅速繁殖，獲得大量的培養(yǎng)物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。

　　常規(guī)鑒定技術(shù)

　　一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀(guān)察

　?。薄⑽⑸锏男螒B(tài)結(jié)構(gòu)觀(guān)察主要是通過(guò)染色，在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀(guān)察，直觀(guān)地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。

　?。?、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細(xì)菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。以此可以對(duì)不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培養(yǎng)特性的觀(guān)察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

　　二、生理生化試驗(yàn)

　　微生物生化反應(yīng)：指用化學(xué)反應(yīng)來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類(lèi)鑒定中的重要依據(jù)之一。

　　微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：

　?。薄⑻墙徒庠囼?yàn)

　　不同微生物分解利用糖類(lèi)的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。

　　２、淀粉水解試驗(yàn)

　　某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。

　　３、v-p試驗(yàn)

　　某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱(chēng)v－p（+）反應(yīng)。

　　４、甲基紅（methyl red）試驗(yàn)

　　腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基ph值下降至ph4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。

　?。?、靛基質(zhì)（imdole）試驗(yàn)

　　某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。

　?。丁⑾跛猁}（nitrate）還原試驗(yàn)

　　有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾?。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn)。

　?。贰⒚髂z（gelatin）液化試驗(yàn)

　　有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱(chēng)類(lèi)蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。

　?。浮⒛蛩孛福╱rease）試驗(yàn)

　　有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖?，?xì)菌均能合成此酶。其活性最適ph為7.0。

　?。?、氧化酶（oxidase）試驗(yàn)

　　氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素c氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素c再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。

　　10、硫化氫（H2S）試驗(yàn)

　　有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。

　　11、三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)

　　12、硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力（sim）瓊脂試驗(yàn)

　　三、化學(xué)成分分析

　　微生物保存

　　基本原理是在挑選優(yōu)良純培養(yǎng)物并使其處于休眠狀態(tài)基礎(chǔ)上，人為地創(chuàng)造一個(gè)有利于休眠的環(huán)境，使其長(zhǎng)期保存后仍能保持菌種原有的優(yōu)良特性。基本措施是低溫、真空、干燥。

　　保藏方法：

　　1、定期移植法

　　亦稱(chēng)傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，完成培養(yǎng)于4～6℃進(jìn)行保存并間隔一定時(shí)間（3-6個(gè)月）進(jìn)行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。

　　2、液體石蠟法

　　指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)好后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個(gè)斜面，再直立放置于低溫（4～6℃）干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。

　　3、真空冷凍干燥法

　　指將保藏的菌種細(xì)胞或孢子懸浮于保護(hù)劑中，經(jīng)預(yù)凍后在真空條件下使水分升華，再經(jīng)真空封存后保存的一種長(zhǎng)期菌種保存方法。

　　4、-80℃低溫凍結(jié)法

　　將菌種懸浮于保護(hù)劑中，在－80℃冰箱中凍結(jié)保存的一種長(zhǎng)期菌種保藏方法。

　　5、液氮超低溫凍結(jié)法

　　指懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮?dú)庀嘀斜４娴囊环N長(zhǎng)期菌種保藏方法。

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