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溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色 | |||
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防止溶血,紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),以HRP為標(biāo)記的ELISA 測定中,溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細(xì)菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP也會發(fā)生假陽性反應(yīng)。一般說來,5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃,標(biāo)本在冰箱中保存時間過長導(dǎo)致血清IgG聚合,使間接法的試劑本底加深。逾越一周測定的需-20℃保存。凍結(jié)血清融解后,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,應(yīng)充分混勻并防止發(fā)生氣泡?;鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾,廓清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清標(biāo)本如需保管作多次檢測,宜少量分裝冰存。保管血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作,也可加入適當(dāng)防腐劑。
要注意防止出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán),其有類似過氧化物的活性,因此,以HRP為標(biāo)記酶的ELISA 測定中,如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高,則其就很容易在溫育過程中吸附于固相,從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。
樣本的采集及血清分離中要注意盡量防止細(xì)菌污染,一則細(xì)菌的生長,其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白發(fā)生分解作用;二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌β-半乳糖苷酶自身會對用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定方法發(fā)生非特異性干擾。血清標(biāo)本如是以無菌操作分離,則可以在28℃下保存一周,如為有菌操作,則建議冰凍保管。樣本的長時間保存,應(yīng)在-70℃以下。
冰凍保管的血清標(biāo)本須注意防止因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對標(biāo)本中的蛋白等分子發(fā)生破壞作用,從而引起假陰性結(jié)果。此外,凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意,不要進(jìn)行劇烈振蕩,反復(fù)顛倒混勻即可標(biāo)本在保管中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時,應(yīng)離心沉淀后取上清檢測
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