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| 土壤中微生物分離純化培養(yǎng)需要掌握的實驗原理 | |||
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實驗一 常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒
一、實驗?zāi)康?/span>
了解培養(yǎng)基的配制原理；掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。
二、實驗原理
培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據(jù)微生物的種類和實驗?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，所以可供微生物生長繁殖之用。
干熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達到殺死微生物的效果。
三、試劑與器材
1.器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。
2.試劑 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂
四、實驗內(nèi)容
1.稱量→溶化→調(diào)pH→過濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→無菌檢查
2.干熱滅菌：裝入待滅菌物品→升溫→恒溫→降溫→開箱取物
3.高壓蒸汽滅菌：加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查
4.過濾除菌：組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌
五、關(guān)鍵步驟及注意事項
1.要嚴格按配方配制。
2.調(diào)pH不要過頭。
3.干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70?C以下放物、取物。
4.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時降壓回零取物。
5.過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時，壓力要適當，不可太猛太快，濾膜要注意清洗保存。
六、思考題
1.培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的?
2.在配制培養(yǎng)基的操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?
3.培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基應(yīng)具備哪些條件?為什么?
4.培養(yǎng)基的配制原則是什么?
實驗二
土壤中微生物分離純化培養(yǎng)
一、實驗?zāi)康?/span>
掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的生長特征；進一步熟練和掌握微生物無菌操作技術(shù)；掌握微生物培養(yǎng)方法。
二、實驗原理
從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的分離、純化方法：單細胞挑取法，稀釋涂布平板法，稀釋混合平板法，平板劃線法 稀釋涂布平板法步驟：倒平板－制備土壤污水稀釋液－涂布－培養(yǎng)－挑菌落；平板劃線法步驟：倒平板－標記培養(yǎng)基名稱－劃線。
三、試劑與器材
1.器材 盛9m1無菌水的試管、盛90m1無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環(huán)、酒精燈、無菌培養(yǎng)皿、顯微鏡、血細胞計數(shù)板等。
2.試劑 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏1號培養(yǎng)基，查氏培養(yǎng)基
四、實驗內(nèi)容
1.土壤稀釋液的制備
2.微生物分離純化：稀釋涂平板法，平皿劃線分離法，微生物培養(yǎng)技術(shù)
五、關(guān)鍵步驟及注意事項
1.掌握含菌培養(yǎng)基的配制，嚴格控制溫度。
2.平板劃線應(yīng)防止染菌，同時應(yīng)注意劃線深度及密度。
六、思考題
1.如何確定平板上某單個菌落是否為純培養(yǎng)?請寫出實驗的主要步驟。
2.如果要分離得到極端嗜鹽細菌，在什么地方取樣品為宜?并說明理由。
實驗三
菌種保藏
一、實驗?zāi)康?/span>
1.學習并掌握菌種保藏的基本原理。
2.掌握常用的幾種不同的菌種保藏方法。
二、實驗原理
微生物個體微小、代謝旺盛、生長繁殖快，如果保存不妥容易發(fā)生變異和雜菌污染，甚至導致細胞死亡等現(xiàn)象。因此，保存好菌種是非常必要和重要的。常用的菌種保藏方法包括傳代培養(yǎng)法、載體法、懸液法、冷凍法和真空干燥法
三、試劑與器材
1.材料 大腸桿菌、青霉菌、放線菌
2.試劑 液體石蠟、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％鹽酸、無水氯化鈣、食鹽、干冰
3.器材 無菌吸管、無菌滴管、無菌培養(yǎng)皿；安額管、凍干管、40目與100目篩子、油紙、濾紙條(0.5X1.2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空壓力表、噴燈、L形五通管、冰箱、低溫冰箱(—30℃)、超低溫冰箱和液氮罐等。
四、實驗內(nèi)容
1.斜面保藏法
2.液體石蠟法
3.穿刺保藏法
4.砂土管保藏法
5.冷凍真空干燥保存法
五、關(guān)鍵步驟及注意事項
1.清楚各種保藏方法的優(yōu)缺點，針對不同要求選擇適宜的保藏方法。
2.熔封安瓶時防止封閉不嚴。
3.液氮凍存操作應(yīng)防止凍傷。
六、思考題
根據(jù)你自己的實驗。談?wù)?--2種菌種保藏方法的利弊?
實驗四
細菌形態(tài)觀察及單染色
一、實驗?zāi)康?/span>
1.了解簡單染色法的原理，并掌握其操作方法。
2.學習并掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無菌操作技術(shù)。
3.鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法。
4.初步認識細菌的形態(tài)特征。
二、實驗原理
細菌個體微小，且較透明，必須借助染色法使菌體著色，與背景形成鮮明的對比，以便在顯微鏡下進行觀察。根據(jù)實驗?zāi)康牟煌?，可分為簡單染色法、鑒別染色法和特殊染色法等。簡單染色法是最基本的染色方法，是利用單一染料對細菌進行染色。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。常用堿性染料進行簡單染色。
三、試劑與器材
1.材料 大腸桿菌，枯草芽孢桿菌
2.試劑 呂氏堿性美藍染液(或草酸銨結(jié)晶紫染液)、齊氏石炭酸復紅染液。
3.器材 顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲苯)等。
四、實驗內(nèi)容
簡單染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢
五、關(guān)鍵步驟及注意事項
1.涂片時，生理鹽水及取菌不宜過多，涂片應(yīng)盡可能均勻，
2.水洗步驟水流不宜過大，過急，以免涂片薄膜脫落。
六、思考題
1.你認為制備細菌染色標本時，尤其應(yīng)該注意哪些環(huán)幣?
2.為什么要求制片完全干燥后才能用油鏡觀察?
3.如果你的涂片未經(jīng)熱固定，將會出現(xiàn)什么問題?如果加熱溫度過高、時間太長，又會怎樣呢?
實驗五
放線菌及霉菌形態(tài)觀察
一、實驗?zāi)康?/span>
1.了解放線菌、霉菌形態(tài)觀察的原理。
2.學習并掌握觀察放線菌、霉菌形態(tài)的操作方法。
3.初步了解放線菌、霉菌的形態(tài)特征。
二、實驗原理
放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性細菌。常見放線菌大多能形成菌絲體，緊貼培養(yǎng)基表面或深入培養(yǎng)基內(nèi)生長的叫基內(nèi)菌絲(簡稱“基絲”)，基絲生長到一定階段還能向空氣中生長出氣生菌絲(簡稱“氣絲”)，并進一步分化產(chǎn)生孢子絲及孢子。有的放線菌只產(chǎn)生基絲而無氣絲。在顯微鏡下直接觀察時，氣絲在上層、基絲在下層，氣絲色暗，基絲較透明。孢子絲依種類的不同，有直、波曲、各種螺旋形或輪生。
霉菌可產(chǎn)生復合分枝的菌絲體，分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多，常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。人們設(shè)計了各種培養(yǎng)和觀察方法，這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)特征。本實驗采用插片法。
插片法：將放線菌接種在瓊脂平板上，插上滅菌蓋玻片后培養(yǎng)，使放線菌菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻上。觀察時，輕輕取出蓋玻片，置于載玻片上直接鏡檢。這種方法可觀察到放線菌自然生長狀態(tài)下的特征，而且便于觀察不同生長期的形態(tài)。
三、試劑與器材
1.材料 黑曲霉、青霉和根霉，細黃
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