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		ips技術(shù)在研究中存在的技術(shù)問題及優(yōu)化方法

　　誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)是通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子使成體細(xì)胞直接重編程為胚胎干細(xì)胞(ESCs)樣的多能性干細(xì)胞(Takahashi and Yamanaka，2006)。

　　1.1 最初獲得iPS技術(shù)路線

　　2006年，日本Yamanaka研究小組采用體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，從24個基因中篩選出能使成體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成干細(xì)胞的基因，通過研究最終確定了Oct4、Sox2、c—Myc和Klf4 4個轉(zhuǎn)錄因子基因；通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將上述4個轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)胄∈笃つw成纖維細(xì)胞中；在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)條件下，以Fbxl5為標(biāo)記物進(jìn)行篩選，獲得了Fbxl5+的干細(xì)胞。新獲得的這種細(xì)胞系在細(xì)胞形態(tài)、生長特性、表面標(biāo)志物等方面與胚胎干細(xì)胞非常相似，將這些克隆狀細(xì)胞放在飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)，每個細(xì)胞都顯示出與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)相似的形態(tài)。經(jīng)鑒定，這些iPS無論在形態(tài)學(xué)上還是在分子水平上，其特性均與ESCs高度相似。在疾病治療中的用途 Hanna等將小鼠皮膚的成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞，再定向誘導(dǎo)其分化為造血干細(xì)胞，移植后用于治療人類鐮狀細(xì)胞性貧血的小鼠動物模型，取得顯著的治療效果，具體應(yīng)用如圖1。

　　圖1 利用Ips治療鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病模型

　　1.2 iPS誘導(dǎo)形成的機制

　　在體細(xì)胞重編程過程中，體細(xì)胞特異表達(dá)的標(biāo)記基因(如成纖維細(xì)胞的Thy1)首先被抑制；隨后多潛能性細(xì)胞的一些特異表型出現(xiàn)，如堿性磷酸化酶和SSEAl的表達(dá)；在iPs細(xì)胞形成的晚期，才激活內(nèi)源性的Oct4、Sox2和Nanog等多潛能性細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子；在重編程晚期還可檢測到X染色體的激活、端粒酶活性的增加和端粒長度的延長。這些基因的激活與抑制都伴隨著組蛋白表觀遺傳修飾和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。C—Myc在重編程早期抑制體細(xì)胞特異表達(dá)的標(biāo)記基因中起重要作用，其他3個因子Oct4、Sox2和Klf4則在激活多潛能性細(xì)胞的標(biāo)記基因中起作用。如果未能有效地激活多潛能性標(biāo)記基因(特別是晚期激活的多潛能性基因)和改變它們的表觀遺傳修飾，細(xì)胞就處于部分重編程的狀態(tài)。

　　1.3 iPS研究的意義

　　iPS 細(xì)胞同樣具有自我更新和分化的全能性,其功能與胚胎干細(xì)胞類似,無需制造胚胎, 從任何組織的細(xì)胞都可以制造出具有干細(xì)胞功能的細(xì)胞, 避免了轉(zhuǎn)基因面臨的倫理問題, 更重要的是簡化了制備轉(zhuǎn)基因動物的過程。iPS 產(chǎn)生機理與相關(guān)技術(shù)的深入研究,將會給治療人類疑難疾病、組織修復(fù)與再生以及生物制藥等諸多生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來新的發(fā)展機遇。源自患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，進(jìn)一步用于自體移植可避免免疫排斥問題，目前故iPS細(xì)胞的誕生被譽為生命科學(xué)領(lǐng)域新的里程碑。

　　1.4 iPS研究成果

　　自1962年，Gurdon將某些特定的成體細(xì)胞如青蛙的皮膚細(xì)胞，經(jīng)過適當(dāng)?shù)囊浦矊嶒?，產(chǎn)生新的蝌蚪以來，Ips技術(shù)的研究有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。如2012年10月8日，英國研究員John B.Gurdon和日本科學(xué)家Shinya Yamanaka，因為在Ips的成體細(xì)胞重編程成為干細(xì)胞的研究中做出了巨大貢獻(xiàn)，共同獲得2012年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。2013年6月，美國Smith對誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行分化，在試管內(nèi)制造出了無數(shù)的人類紅血細(xì)胞和血小板。2013年7月，美國Samuel等使用人體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞制造出能在實驗鼠體內(nèi)存活280d的人造血管。其他發(fā)展歷程中的重大事件.

　　2 . iPS的發(fā)展進(jìn)程

　　2.1iPS相關(guān)因子的功能

　　Oct 4( Octamer- binding Transcription Factor4,八聚體轉(zhuǎn)錄因子4 ) 基因是P O U轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞自我更新、維持其全能性、細(xì)胞增殖的最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，是參與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞重編碼過程最為重要的因子。Oct4是維持ESC全能性和自我更新的關(guān)鍵基因，在未受精的受精卵卵母細(xì)胞中即可表達(dá)。當(dāng)敲除Oct 4或Oct 4發(fā)生突變時，胚胎不能形成內(nèi)細(xì)胞團，擬胚體發(fā)生凋亡，胚胎干細(xì)胞喪失全能性。Oct 4與Nanog、Sox2形成網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)通路，調(diào)控胚干細(xì)胞的全能性。這3種基因?qū)Υ罅炕蛲ㄟ^前饋系統(tǒng)、自身調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控來維持胚胎干細(xì)胞維持全能性及抑制分化。

　　Sox2基因是SRY(性別決定基因)超家族相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Sox家族成員，在動物界廣泛存在。Sox2基因是細(xì)胞重編程的重要基因之一，參與細(xì)胞的形成，維持胚胎干細(xì)胞全能性和自我更新，決定動物性別與分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、眼的發(fā)育等過程。作為Oct4基因的協(xié)同基因，Sox2在胚胎形成過程中，Oct4和Sox2含量會逐漸降低，Sox2突變可能引起Oct4基因突變，進(jìn)而引發(fā)干細(xì)胞喪失全能性。

　　Nanog是NK家族基因，參與維持胚胎干細(xì)胞全能性，與生殖細(xì)胞腫瘤生成的關(guān)系密切，參與人成纖維細(xì)胞重編程為iPS過程。Nanog突變體會導(dǎo)致擬胚體的形成缺陷，缺失不會影響干細(xì)胞自我更新能力和形成胚胎嵌合體的能力，但會促進(jìn)Es細(xì)胞多向分化，使胚胎內(nèi)胚層自發(fā)分化為內(nèi)臟、體壁和腔室，而其他胚層細(xì)胞凋亡。因此，Nanog在胚胎干細(xì)胞中的作用相當(dāng)于一個開關(guān)，調(diào)節(jié)ES細(xì)胞自我更新和多向分化。

　　Klf4是Klf蛋白家族的成員之一，具有多串聯(lián)型鋅指結(jié)構(gòu)，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化。與Oct4、Sox2和c—Myc共同調(diào)控干細(xì)胞自我更新和維持全能性，參與人和小鼠體細(xì)胞重編程為iPS過程。敲除或低表達(dá)Klf4基因不會導(dǎo)致胚胎凋亡，不會影響其自我更新和胚胎發(fā)育但會導(dǎo)致遺傳疾病。

　　c—Myc基因是細(xì)胞癌基因的重要成員，參與細(xì)胞生殖、分化調(diào)節(jié)過程，在小鼠體細(xì)胞重編碼為iPS過程中起重要作用，調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的自我更新和分化。Nakagawafz等研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體細(xì)胞重編程過程中c—Myc可敲除，并提高重編程率、降低腫瘤發(fā)生。

　　2.2 iPS研究中存在的技術(shù)問題及優(yōu)化方法

　　實驗證明．iPS細(xì)胞功能幾乎和ESC一樣，表達(dá)ESC的各種表面標(biāo)記．可分化為各種組織細(xì)胞。但還有很多問題有待解決。（1）c—Myc和Klf4屬于致癌因子．用病毒作為載體．可能使致癌因子整合到受體基因組內(nèi)．引發(fā)基因突變產(chǎn)生高致癌性的iPS細(xì)胞。（2）iPS細(xì)胞產(chǎn)生的效率較低，重組率只有0．1％左右。究其原因可能是0ct-4在胃或腸內(nèi)的表達(dá)阻止了原始細(xì)胞的分化或者其他在維持多能性中起重要作用的多聚蛋白以及染色體組的修飾因子ISW I和Brgl被插入的逆轉(zhuǎn)錄病毒激活。（3）安全性問題，誘導(dǎo)生成多功能干細(xì)胞的方法大多都涉及到病毒基因及反轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用，這有可能使所誘導(dǎo)的細(xì)胞發(fā)生異常。（4）由于急性免疫排斥反應(yīng)的存在，來源于多能干細(xì)胞的組織在移植后的存活率很低。

　　解決成瘤性問題、表觀遺傳學(xué)問題、移植排斥問題及提高效率，是將來研究iPS細(xì)胞需要解決的主要問題。據(jù)此，在具體實踐中提出以下優(yōu)化方法：（1）轉(zhuǎn)錄因子及誘導(dǎo)策略的選擇，以此既保證安全性，又提高誘導(dǎo)效率。A、小分子化合物誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)過程中導(dǎo)入一些小分子化合物不但可以促進(jìn)細(xì)胞重編程，甚至可以取代某些轉(zhuǎn)錄因子的作用。例如，最早發(fā)現(xiàn)的BIX-01294（組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a的抑制劑）可以取代Oct4。也有發(fā)現(xiàn)表明細(xì)胞內(nèi)信號分子Wnt3a可以替代原癌基因c-Myc，并提高重編程效率。B、簡化過程：有報道稱，使用Ascl1、Brn2和Mytl1這3種因子可避開多能干細(xì)胞誘導(dǎo)步驟，在體外將MEF（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）直接轉(zhuǎn)變成有功能的神經(jīng)元。簡化誘導(dǎo)步驟使得安全性和誘導(dǎo)效率都得到了很大程度的提升。 C、蛋白質(zhì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，丁盛等( 2009) 報道，在細(xì)胞穿膜肽的協(xié)助下直接將轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白導(dǎo)入MEF，使其成為可長期自我更新的蛋白誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(protein-inducedplu-ripotent stemcells，piPSCs) ，從而取代基因誘導(dǎo)，這種方法避免了遺傳修飾，安全性高，被譽為干細(xì)胞領(lǐng)域的二次革命。但大大降低了iPS的生成率，技術(shù)上有待進(jìn)一步改進(jìn)。D、RNA誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，近期有研究者在重編程過程中加入一些微小RNAs（miRNAs），發(fā)現(xiàn)這些小分子能取代一些重編程因子或提高重編程的效率和速度，可能產(chǎn)生更加安全的ips細(xì)胞。例如：Derrick等將4個關(guān)鍵蛋白質(zhì)的mRNA導(dǎo)入人皮膚細(xì)胞，得到核糖核酸誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，同時使細(xì)胞重新編程的速度提高了一倍，而效率是標(biāo)準(zhǔn)方法的100倍以上。（2）轉(zhuǎn)運載體的選擇，導(dǎo)入的外源因子包含腫瘤相關(guān)基因并不是威脅iPSCs安全性的唯一因素，協(xié)助轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染所用的病毒載體也有誘發(fā)腫瘤的風(fēng)險，為此，尋找更為安全的載體成為iPSCs研究的另一熱點。A、病毒載體: 無論用逆轉(zhuǎn)錄病毒慢病毒還是腺病毒做載體均可能增加病毒感染細(xì)胞的風(fēng)險，為此，Mostoslavsky等首次完成了僅用1個病毒載體同時表達(dá)4種轉(zhuǎn)錄因子，減少了細(xì)胞中病毒整合的位點，也降低了插入突變的概率。B、質(zhì)粒載體: 為了擺脫病毒載體插入細(xì)胞基因組造成的風(fēng)險，有人嘗試使用更為安全的質(zhì)粒載體。在2008年Yamanaka等用兩個質(zhì)粒反復(fù)感染MEF獲得iPSCs其中一個為包含Oct4 Sox2 Klf4的cDNA序列; 另一個為c-Myc的cDNA序列，但由于此法需要質(zhì)粒的多次反復(fù)感染，操作較為復(fù)雜，故未得到大范圍應(yīng)用。

　　3.iPS的應(yīng)用

　　2.2 iPS在臨床治療中的可行性

　　iPS 細(xì)胞的建立進(jìn)一步拉近了干細(xì)胞和臨床疾病治療的距離, iPS 細(xì)胞在細(xì)胞替代性治療以及發(fā)病機理的研究、新藥篩選方面具有巨大的潛在價值。2007年12月, Hanna等用 iPS 細(xì)胞成功治療了小鼠的鐮狀紅細(xì)胞貧血癥, 2009年初, Xu 等用從 iPS 細(xì)胞誘導(dǎo)來的內(nèi)皮前體細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞成功治療血友病A，他們的研究雖然是在小鼠中進(jìn)行的, 然而,這些成果驗證了iPS細(xì)胞在基因治療中的可行性, 從理論和實踐上為人類單基因遺傳病治療奠定了基礎(chǔ)。此外, iPS 細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈現(xiàn), iPS 細(xì)胞在體外已成功地被分化為神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、心血管細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞等,在臨床疾病治療中具有巨大的應(yīng)用價值。

　　2.3 iPS為疾病研究提供體外模型

　　疾病特異性 iPS 細(xì)胞是研究疾病發(fā)生機理的重要工具，可以更好地研究疾病發(fā)病的機理、篩選和開發(fā)新的藥物治療方法。2008年 Dimos 等首次把來自于 80 多歲的肌萎縮側(cè)索硬化癥患者的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)為 iPS 并分化成運動神經(jīng)元。Park 等將10種不同遺傳病患者的細(xì)胞誘導(dǎo)為病人特異性的 iPS 細(xì)胞系。

　　2.4 iPS用于治療罕見疾病

　　美國斯隆-凱特林研究所的 Lee 等研究人員首次用 iPS 細(xì)胞建立了家族性植物神經(jīng)功能不全癥(Familial dysautonomia, FD)的細(xì)胞模型。2012年，美國印第安納大學(xué)報道，他們?nèi)涨坝萌祟愓T導(dǎo)多能干細(xì)胞( iPSc) 療法，成功治愈了一名回旋狀脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮癥患者。

　　2.5 iPS細(xì)胞應(yīng)用于體細(xì)胞核移植技術(shù)

　　利用 iPS 細(xì)胞作為核供體細(xì)胞, 同適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞融合后便可以直接獲得轉(zhuǎn)基因動物。這種將 iPS 細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)同動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合的方法，不僅可以提高動物的遺傳本質(zhì), 而且可以打破物種的界限, 獲得用傳統(tǒng)的交配方法無法得到的動物新性狀。

　　2.6 利用iPS技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因豬

　　利用iPS技術(shù)培育出一種準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因豬, 改善它對某種疾病的耐性, 從而改善畜牧業(yè)。目前, 在牛、羊等其它大家畜中尚無這方面的報道, 如果我們能夠建立這些動物的iPS細(xì)胞, 并應(yīng)用其來生產(chǎn)基因打靶或轉(zhuǎn)基因動物, 必然會提高轉(zhuǎn)基因動物的效率,為轉(zhuǎn)基因研究開創(chuàng)一片更加廣闊的天地。

　　4.iPS的展望

　　隨著研究的深入，以前被人們廣泛認(rèn)可的iPSC在移植免疫排斥倫理學(xué)方面的優(yōu)勢，以及與ESCs的相似性等問題都受到了質(zhì)疑。最初人們賦予iPS極高的熱情現(xiàn)如今已漸漸褪去，但iPS的研究不會因此而停下腳步。盡管迄今產(chǎn)生的iPS仍存在著一些問題，iPS在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還是具有巨大的應(yīng)用前景。為了使iPS安全地應(yīng)用到臨床，除了提高重編程效率，進(jìn)行特定組織的高效定向誘導(dǎo)分化之外，未來對iPS的研究同時應(yīng)關(guān)注與臨床應(yīng)用相關(guān)的問題。一旦實現(xiàn)可行、安全、高效、無病毒、無轉(zhuǎn)基因的自體iPS細(xì)胞技術(shù)，必將給醫(yī)學(xué)研究及多種疾病治療帶來深遠(yuǎn)的影響。

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