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多色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)特定的細(xì)胞類(lèi)型
      
  多色流式細(xì)胞術(shù)是一種強(qiáng)大的技術(shù),用于分析細(xì)胞內(nèi)特定的細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)的蛋白質(zhì)。對(duì)于許多類(lèi)型的細(xì)胞,如Th17細(xì)胞,細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物的結(jié)合使用是必要的明確的表型鑒定。表征信號(hào)響應(yīng)于特定的靶細(xì)胞的性質(zhì),可用于表面標(biāo)志物的同時(shí)分析和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。
  細(xì)胞表面染色的技術(shù)是比較標(biāo)準(zhǔn)的,往往依賴(lài)于目標(biāo)蛋白的生物學(xué)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物的最佳染色。根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的位置,與其他分子,它的穩(wěn)定性,不同的細(xì)胞制備和染色方法的建議。細(xì)胞因子,例如,典型的分泌蛋白。但是,如果它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)被困住的,它們可以被污染:BD GolgiStop的?(含莫能菌素)或BD GolgiPlug的?(含布雷菲德菌素甲)如使用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子是相對(duì)使用的溫柔固定和通透賦予由BD Cytofix / Cytoperm?固定和透化解決方案訪問(wèn)。
  相反,細(xì)胞因子,轉(zhuǎn)錄因子通常被定位在細(xì)胞核內(nèi)DNA和其他蛋白質(zhì)結(jié)合。一些蛋白質(zhì)的磷酸化,如Stat5的,導(dǎo)致二聚體的形成,還掩蓋了磷酸化的表位。此外,細(xì)胞內(nèi)磷酸酶可以快速去磷酸化蛋白。因此,處理后的細(xì)胞,必須迅速地固定,并進(jìn)行更強(qiáng)的通透條件允許抗體進(jìn)入細(xì)胞核并進(jìn)入破壞的分子復(fù)合物的抗原表位內(nèi)。
  所用的透化技術(shù)產(chǎn)生負(fù)面影響的細(xì)胞表面和其他細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)。允許進(jìn)入細(xì)胞核,并打開(kāi)DNA /蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)復(fù)合物的相同的技術(shù)往往能細(xì)胞表面抗原變性,防止其被抗體的檢測(cè)。雖然不同的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的檢測(cè)可能需要不同的條件,基本原則是相同的:細(xì)胞是固定的,通透的,然后用熒光抗體染色細(xì)胞。
  細(xì)胞內(nèi)染色的基本原則細(xì)胞固定和通透(象征虛線膜),染色,然后用流式細(xì)胞儀分析。對(duì)于分泌的蛋白質(zhì)的研究中,細(xì)胞首先與一種蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑治療的目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累,以允許..
  胞內(nèi)流式細(xì)胞儀BD工具為了促進(jìn)BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi),已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾個(gè)包,緩沖區(qū)和協(xié)議。此外,許多關(guān)鍵的細(xì)胞表面標(biāo)志的特定熒光抗體測(cè)試幾個(gè)緩沖系統(tǒng),以節(jié)省研究人員的時(shí)間,樣品,和金錢(qián)。常用的為特定的應(yīng)用程序的BD緩沖器包括:
  檢測(cè)細(xì)胞因子BD Cytofix / Cytoperm的固定/通透的解決方案(編號(hào):554722)是適用于染色大多數(shù)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面標(biāo)志。該緩沖系統(tǒng)也可用于一些轉(zhuǎn)錄因子和其它細(xì)胞內(nèi)蛋白染色。該緩沖系統(tǒng)包含溫和的洗滌劑以及與甲醛固定液。
  轉(zhuǎn)錄因子是專(zhuān)為BD Pharmingen公司的轉(zhuǎn)錄因子的緩沖液設(shè)置(部件號(hào)五十六萬(wàn)二千七百二十五分之五十六萬(wàn)二千五百七十四)單獨(dú)或結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄因子染色。該緩沖系統(tǒng)包含溫和的洗滌劑以及與甲醛固定液。
  檢測(cè)磷酸化蛋白的BD Phosflow?燙發(fā)緩沖III(貨號(hào):558050)推薦的通透緩沖通過(guò)流式細(xì)胞儀phosphoepitope檢測(cè)。彼爾姆緩沖III是一個(gè)嚴(yán)酷的以酒精為基礎(chǔ)的緩沖區(qū)。也可替代通透性緩沖區(qū),以適應(yīng)特定的實(shí)驗(yàn)要求。
  優(yōu)化細(xì)胞通透性條件不同表位的位置最優(yōu)的通透條件決定的抗原表位的細(xì)胞內(nèi)的無(wú)障礙。磷酸701表位(橙色)位于的STAT蛋白二聚體,而磷酸絲氨酸727表位是位于外二聚化地區(qū)。對(duì)于的磷酸701網(wǎng)站,如燙發(fā)緩沖III染色所需的更嚴(yán)厲的緩沖。以誘導(dǎo)蛋白的磷酸化,人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)被留下未處理的( - )或(+)激活的人IFN-α(急性髓pY701)或PMA(急性髓pS727)。細(xì)胞被固定使用BD Cytofix?固定緩沖通透使用BD Phosflow?燙發(fā)緩沖區(qū)I,II,III,IV,染色前用熒光磷酸化抗體。
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