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| 常用的一些測定蛋白質(zhì)分子量的幾種方法介紹 | |||
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1．凝膠過濾法
凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質(zhì)分子量范圍，在此范圍內(nèi)，分子量的對數(shù)和洗脫體積之間成線性關(guān)系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質(zhì)為標準，進行凝膠層析，以每種蛋白質(zhì)的洗脫體積對它們的分子量的對數(shù)作圖，繪制出標準洗脫曲線。未知蛋白質(zhì)在同樣的條件下進行凝膠層析，根據(jù)其所用的洗脫體積，從標準洗脫曲線上可求出此未知蛋白質(zhì)對應的分子量。
2．SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法
蛋白質(zhì)在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子的大小、分子形狀和所帶電荷的多少。SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種去污劑，可使蛋白質(zhì)變性并解離成亞基。當?shù)鞍踪|(zhì)樣品中加入SDS后，SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上大量的強負電荷，并且使蛋白質(zhì)分子的形狀都變成短棒狀，從而消除了蛋白質(zhì)分子之間原有的帶電荷量和分子形狀的差異。這樣電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，蛋白質(zhì)分子在電泳中的相對遷移率和分子質(zhì)量的對數(shù)成直線關(guān)系。以標準蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)和其相對遷移率作圖，得到標準曲線，根據(jù)所測樣品的相對遷移率，從標準曲線上便可查出其分子質(zhì)量。
3．沉降法（超速離心法）
沉降系數(shù)（S）是指單位離心場強度溶質(zhì)的沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分子的大小。蛋白質(zhì)溶液經(jīng)高速離心分離時，由于比重關(guān)系，蛋白質(zhì)分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質(zhì)顆粒大小成正比，應用光學方法觀察離心過程中蛋白質(zhì)顆粒的沉降行為，可判斷出蛋白質(zhì)的沉降速度。根據(jù)沉降速度可求出沉降系數(shù)，將S帶入公式，即可計算出蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。
一般的方法：
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量
[原理]
十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate, 簡稱SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在實驗基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新技術(shù)。用這種方法測定蛋白質(zhì)的分子量具有快速靈便，設(shè)備簡單等優(yōu)點。
蛋白質(zhì)的電泳遷移率在一般的電泳方法中，主要取決于它在某PH下所帶的凈電荷量、分子大小（即分子量）和形狀的差異性，而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對大多數(shù)蛋白質(zhì)，主要取決于它們的分子量，與原有的電荷量和形狀無關(guān)。
SDS是一種陰離子表面活性劑，在一定的條件下，它能打開蛋白質(zhì)氫鍵和疏水鍵，并按比例地結(jié)合到這些蛋白質(zhì)分子上形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復合物，每克蛋白質(zhì)一般結(jié)合1.4克SDS。SDS與蛋白質(zhì)的定比結(jié)合使蛋白質(zhì)-SDS復合物均帶上相同的負電荷，其量遠遠超過蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。在水溶液中，蛋白質(zhì)-SDS復合物具有相同的構(gòu)象，近似雪茄煙形的長橢園棒（短軸均為1.8nm，長軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比變化），克服了蛋白質(zhì)間原有的形狀差異。這樣蛋白質(zhì)-SDS復合物在凝膠中的遷移率不再受原有電荷和形狀的影響，而只是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。蛋白質(zhì)分子量與電泳遷移率間的關(guān)系可用下式表示：
lgMr = K – bm
式中 Mr為分子量；K為常數(shù)；b為斜率；m為遷移率。
因此，用本法測定蛋白質(zhì)的分子量只需根據(jù)待測蛋白質(zhì)在已知分子量的標準蛋白質(zhì)的lgMr～遷移率的圖中的位置，就能得知分子量。
用本法測得的分子量，除單鏈蛋白質(zhì)外，均不是天然蛋白質(zhì)的完整分子量，而是組成這些蛋白質(zhì)的亞基或肽鏈的分子量。本法對一些電荷異常，或構(gòu)象異常，或帶有大輔基的蛋白質(zhì)不適用，如組蛋白F1和某些糖蛋白等。對一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等也不適用。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳按照凝膠電泳系統(tǒng)中的緩沖液、pH值和凝膠孔徑的差異可分為SDS-連續(xù)系統(tǒng)電泳和 SDS-不連續(xù)系統(tǒng)電泳兩類；按照所制成的凝膠形狀和電泳方式又可以分為SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直管型電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳兩類。 |
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